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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷酸性反应遮盖组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点进行分析技术服务。
用英语标题格式：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
常常名称：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
企业机构：山东大学
探究资料：拟南芥侧根
拜谱供应工艺：磷过酸绘制组学、LC-MS/MS磷过酸位点解析
研究方案理念：
PART 01 学习的结果
01、萌发素力促VIK的磷碱化基本转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应球胆固醇成分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 成长素力促VIK的磷过酸试述转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷硝化作用实践。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酒曲双杂交育种分享（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相辅相成激光散斑进行实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷碱化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。即时一定量PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素警报主动管控 LR 发育状况
能够探讨两根VIK T-DNA加上变化的体（vik-2和vik-3），出现与天然的型相对，变化的体的LR相对容重、LR原基（LRP）和已出现发肓的LR差异性削减，尤为是vik-2（图2）。相同，过展示VIK的转dna植物体表面出LR相对容重曾加。然而，在vik-2变化的体经验下展示VIK的转dna植物体还原了LR出现发肓一些缺陷。出现素进行处理研究反映出，vik-2变化的体对出现素诱导型的LR出现发肓反应迟钝变弱，反映出VIK在出现素监测LR出现发肓中起根本意义。 
图2 VIK介导的产生素信息径路顺向干预LR的大
03、VIK 与ERF13 来进行物理化学互交
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光互替 （BiFC）和免疫性共沉淀自己研究（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13互相影响
04、VIK以正反两面馈的途径调整ERF13磷酸性反应
通过磷碱化球蛋白组学具体分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突然变化感觉显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正负极馈方式英文磷硝化作用ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷硝化作用促进会ERF13化学降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体实践和身体里实践，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸养成和磷酸解离甲基化体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚神经细胞追踪定位剖析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用会加快了ERF13挥发
06、VIK 介导的 ERF13 磷硝化作用调接 LR 的诞生
探析进一歩探析了VIK调节的ERF13挥发在侧根（LR）大中的意义。顺利通过相比的有所不同转DNA绿植的系的LR表型，会发觉过表答方式出ERF13抑止了LR的诞生，在vik突变的体中在此种抑止意义加强，而在过表答方式出YFP-VIK的底色下在此种抑止意义减退（图6）。除此以外，相比ERF13的的有所不同磷碱化虚拟和磷酸灭活突变体的过表答方式出绿植的系，会发觉ERF132A-Myc（磷酸灭活）的绿植的系LR诞生减少，而ERF132D-Myc（磷碱化虚拟）的绿植的系LR诞生略多。这一些最终表面，VIK介导的ERF13磷碱化和挥发推进了LR的诞生。 
图6 VIK介导的ERF13磷酸性反应增进LR的诞生
07、VIK在侧根生长中磷碱化并不稳LBD18核蛋白
依据研究两人VIK T-DNA嵌入人类基因组变异体（vik-2和vik-3），会发现与原生态型相对比，人类基因组变异体的侧根（LR）高导热系数、LR原基（LRP）和已健康的LR取得避免，针对是vik-2（图7）。相近，过抒发VIK的转人类基因植物组茎叶行为 出LR高导热系数延长。与此同时，在vik-2人类基因组变异体大环境下抒发VIK的转人类基因植物组茎叶恢复如初了LR健康缺点。发芽素治理试验反映，vik-2人类基因组变异体对发芽素促进的LR健康化学反应弱化，反映VIK在发芽素监测LR健康中充分利用主要帮助。 
图7 VIK 在LR组成流程中会磷硝化作用和平衡LBD18血清
PART 02 软文个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用蛋清质组学具体分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的出现素表现调接侧根产生
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的球氨基酸组学、修饰语球氨基酸组学、代谢率组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—高深入DIA·磷酸性反应突显组，采用创新含有的技术+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现生物样表10w+、植被样表5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
符合论文文献：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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